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免疫組化IHC常見問題點(diǎn)擊次數(shù)：1856 更新時(shí)間：2021-08-16
| IHC信號(hào)微弱/無信號(hào) | |
| 問題 | 解決方案 |
| 抗體效力 | a. 抗體效價(jià)不高。可通過增加抗體使用濃度，延長(zhǎng)抗體孵育時(shí)間進(jìn)行調(diào)整。 b. 所用抗體不適用于IHC實(shí)驗(yàn)。建議在非變性WB上測(cè)試該抗體，以確保抗體識(shí)別非變性抗原，或是選用通過IHC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的抗體。 c. 一抗二抗不匹配。使用針對(duì)一抗物種來源的二抗，如一抗宿主為rabbit，則須使用anti-rabbit的二抗。 d. 抗體失活。避免將標(biāo)記熒光基團(tuán)的二抗放置于光照環(huán)境。 |
| 酶底物失活或呈色時(shí)波長(zhǎng)設(shè)置錯(cuò)誤 | a. 顯色溶液失去作用，可能是由于底物緩沖液中含有酶抑制劑，或底物緩沖液的pH值不適當(dāng)。建議取一滴二抗標(biāo)記酶與底物溶液反應(yīng), 可確認(rèn)顯色溶液是否失去活性。 b. 錯(cuò)誤的激發(fā)波長(zhǎng)。呈色前確保激發(fā)波長(zhǎng)與使用的熒光基團(tuán)相匹配。 |
| 樣品制備問題 | a. 脫蠟作用不足。建議延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間，使用新鮮配制的二甲苯。 b. 固定液（福爾馬林或 PFA) 可能改變表位。建議利用抗原修復(fù)方式使表位暴露出來或縮短固定作用的時(shí)間。 c. 固定作用不適當(dāng)。避免延遲固定或過度固定，一般建議至少固定6小時(shí)以上，18~24小時(shí)已可滿足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。 d. 冰凍切片樣品保存期過長(zhǎng)。冰凍切片制備完成后，最好于1-2個(gè)月內(nèi)用完，超過6個(gè)月的話，建議制備新的玻片。 e. 熒光染色樣品保存不當(dāng)。熒光基團(tuán)在光線下暴露時(shí)間過長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致信號(hào)減弱，建議在避光環(huán)境下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和保存樣品，也可使用防熒光淬滅的封片劑封固樣本。 |
| 樣品屬性 | a. 靶蛋白含量低。建議設(shè)置為陽性対照組，增加抗體使用量或利用放大步驟來放大信號(hào)。 b. 靶蛋白為核蛋白而抗體不能穿透細(xì)胞核。建議在封閉溶液與抗體稀釋液中加入滲透試劑，以促進(jìn)抗體滲透到細(xì)胞內(nèi)。 c. 靶蛋白為膜蛋白而表位可能因?yàn)闈B透作用被破壞或移除。建議將緩沖液中的滲透試劑減少或移除。 d. 較厚的組織。如斑馬魚全胚胎或染色建議做細(xì)胞破膜，以便抗體順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。 關(guān)鍵步驟：在每次的實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置陽性與陰性對(duì)照組，以確認(rèn)是該次實(shí)驗(yàn)的抗體、試劑、組織切片、實(shí)驗(yàn)過程的問題，還是靶蛋白自身表達(dá)量低的問題。 |
| IHC非特異性染色/背景值比較高 | |
| 問題 | 解決方案 |
| 固定方式或組織自身可能存在自發(fā)熒光 | a. 嘗試用非醛類替代醛類。 b. 用淬滅自發(fā)熒光的染料或方法處理組織樣品：如硼氫化na、短波長(zhǎng)的UV照射、蘇丹黑等。 c. 將石蠟包埋樣品的方法換成冰凍切片（OCT或明膠），減少固定液的影響。 d. 選擇不會(huì)與自發(fā)熒光競(jìng)爭(zhēng)的熒光染料。福爾馬林、PFA或戊二醛等會(huì)產(chǎn)生高背景的熒光，尤其在使用綠色、藍(lán)色和紅色波長(zhǎng)光譜范圍時(shí)；組織中的紅細(xì)胞或膠原蛋白等組分會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的自發(fā)熒光，尤其是使用綠色和紅色通道的熒光檢測(cè)時(shí)。 e. 組織沖洗不*，有固定液殘留。 f. 使用福爾馬林或PFA固定過久。一般建議至少固定6小時(shí)以上，18~24小時(shí)已可滿足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，注意：如固定時(shí)間到了無法繼續(xù)后續(xù)脫水、包埋程序，一定要將組織置換到PBS保存，切勿一直泡于固定液中，否則有可能造成蛋白交聯(lián)無法修復(fù)。 g. 配置新鮮的固定液 |
| 封閉、洗脫或顯色問題 | a. 增加封閉液濃度、延長(zhǎng)封閉時(shí)間。 b. 更換封閉液成分，注意: 封閉液成分不可與一抗物種同來源，最好與二抗物種同源，如二抗來自馬血清，使用馬血清可得到較干凈的背景。 c. 底物過量：縮短底物孵育時(shí)間。 d. 信號(hào)過度放大：縮短信號(hào)放大試劑孵育時(shí)間。 e. 洗脫液不適合：如果原本是用PBS，可更換使用TBS |
| 抗體濃度太高或非特異性結(jié)合 | a. 降低抗體濃度，如1：100調(diào)整為1：1000。 b. 縮短抗體孵育時(shí)間，并在4°c 孵育。 c. 增加封閉緩沖液濃度。 d. 做多個(gè)目標(biāo)蛋白染色時(shí)，建議使用預(yù)吸附二抗減少與其他物種一抗的交互作用。 e. 針對(duì)二抗與組織發(fā)生非特異性結(jié)合的情況建議每次實(shí)驗(yàn)都要設(shè)置一組不加一抗，只加二抗的對(duì)照組，才能確認(rèn)信號(hào)是來自高背景值還是真實(shí)信號(hào)。 |
| 內(nèi)源性酶（過氧化氫酶或堿性磷酸酶） | a. 使用酶抑制劑。 - 過氧化物酶：使用H2O2 (0.3% v/v) - 堿性磷酸酶：使用 Levamisol (2 mM) |
| 內(nèi)源性生物素 | 與 Avidin 孵育以封閉生物素 |
| 組織問題 | a. 脫蠟不*，可能導(dǎo)致細(xì)胞核染色在呈相時(shí)模糊，亦可能導(dǎo)致抗體無法辨認(rèn)抗原或者高背景值。 b. 抗原修復(fù)方式不適合，建議更換修復(fù)溶液成分或方法。 c. 一抗與組織物種同源。較常發(fā)生在使用鼠源抗體染鼠源組織時(shí)，除了避開同樣物種來源的一抗和組織之外，也可以使用 Mouse-on-Mouse IHC染色試劑盒 (GTX83396) 迸行實(shí)驗(yàn)。 d. 任何時(shí)候都不要讓組織干掉。 |
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