PCR實驗技術(shù)
PCR（聚合酶鏈式反應）


【原理】
PCR（polymerase chain reaction）用于在體外將微量的目標DNA大量擴增，以便進行分析。反應體系：①樣品DNA；②引物（primer），是人工合成的一對寡核苷酸鏈（約15-20個核苷酸），用于擴增夾在雙引物與模板DNA互補區(qū)之間的區(qū)域；③4種dNTP；④Tag DNA聚合酶，是從一種嗜熱水生菌（Thermus aquaticus）中分離出來的。此酶zui適作用溫度為75～80℃，但短時間在95℃下不失活。⑤適宜的緩沖體系和適量的Mg2+。反應過程：①變性：將反應液置于PCR儀中，提高溫度（約90-95℃）使DNA雙鏈解離；②復性：降溫（約60℃左右）退火，使引物與模板結(jié)合；③延伸：升溫度至70-75℃，在引物的引導下合成模板單鏈的互補鏈，從而形成DNA雙鏈片段；④重復上述“變性——復性——延伸”的過程。zui初幾次循環(huán)中形成的長鏈DNA較多，但隨著反應的進行，長鏈DNA以算術(shù)級數(shù)增加，而夾在兩個引物之間的目標DNA以指數(shù)級數(shù)增長，經(jīng)大約20—30次循環(huán)后，擴增產(chǎn)物中主要是目標DNA。

【材料】
1. 試劑和溶液 
（1）10 × PCR緩沖液
500 mM 氯化鉀
100 mM Tris-Cl （室溫時pH 8.3）
15 mM 氯化鎂
（2）10 mM脫氧三磷酸核苷（dNTPs） 溶液－含有所有四種dNTPs（pH 8.0）
（3）耐熱的DNA 聚合酶：
① Taq DNA 聚合酶是從表達克隆嗜熱水生菌的DNA 聚合酶基因的大腸桿菌提純而來。此酶有5’→3’ DNA聚合酶和5’→3’外切酶活性，但是缺乏3’→5’ 外切酶活性。此酶由分子量約為94 千道爾頓的多肽組成。Taq DNA聚合酶對熱穩(wěn)定，能在較高的溫度下利用引物將單鏈模板合成為DNA。 催化一典型的PCR所需酶量約為2單位。加酶量過多則有可能導致非靶序列的擴增。
Taq DNA 聚合酶缺乏校正功能，在PCR過程中核苷酸摻入錯誤率可達每循環(huán)2 × 10-4個核苷酸，約比使用大腸桿菌DNA聚合酶 I 的Klenow片段時高4倍。對于一個30輪循環(huán)的擴增反應來說，這一摻入錯誤率將導致0.25％的總錯誤頻率。這一頻率似隨和濃度的升高而增大。這些錯誤的摻入可以發(fā)生在擴增產(chǎn)物的任何位置，既有顛換也有轉(zhuǎn)換（但并無長的缺失、嵌合或插入）。
單位的定義：一單位是指于74ºC將l0 nmol的脫氧核糖核苷酸30分鐘內(nèi)摻入到酸性沉淀的物質(zhì)中。其實驗條件是：25 mM TAPS （pH9.3）, 50 mM 氯化鉀, 2 mM 氯化鎂, 1 mM DTT, 0.5 mg/ml 有活性的鮭魚精液DNA, 0.2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP。
② rTth DNA聚合酶是Thermus thermophilus（Tth）和Thermococcus litoralis（Tli）兩種菌中耐熱DNA聚合酶的混合。這種混合酶特別具有5’→3’DNA 聚合酶和3’→5’外切酶（校正）的雙重活性。當按推薦量使用時，此酶可提高保真度及長鏈PCR的產(chǎn)量。
常規(guī)PCR擴增靶DNA序列一般在5 kb以內(nèi)。而rTth DNA 聚合酶可從人類基因組DNA中擴增至19.6 kb的β－球蛋白基因群和噬菌體λDNA的42 kb的片段。 
（4）瓊脂糖凝膠
（5）10 µM的上游和下游引物
（6）DNA模板
（7）對照DNA（含有靶序列的DNA）
（8）DNA長度標準參照物
2. 設備
（1）0.2 ml PCR擴增管
（2）可預先設定擴增方案的溫度循環(huán)器（PCR儀）

【方法】

方法一、基本的PCR方法
下面介紹的基本PCR方法可作為任何PCR擴增的一般指導和出發(fā)點。由于各種PCR反應條件（如PCR擴增次數(shù)、溫度、Taq DNA聚合酶的濃度、引物、氯化鎂以及模板DNA）變異極大，應根據(jù)具體情況，對各種PCR反應條件進行相應調(diào)整。
1．按以下次序，將各成分加入0.2 ml滅菌擴增管中：
成分                     體積                 終濃度
10 × PCR緩沖液                5 µl                    1 ×
10 mM dNTP溶液（pH 8.0）         1 µl             每種0.2 mM
10 µM 上游引物                 2.5 µl                0.5 µM
10 µM 下游引物                 2.5 µl                0.5 µM
5單位/µl 耐熱DNA聚合酶        0.5 µl              2.5單位
DNA模板                       1-10 µl             1 pg-1µg
消毒的蒸餾水                  至50 µl   
* 我們主張，對于多管反應可配制混合液于一管中，然后分裝至各管，以減少試劑損失和各管分別加樣的不準確性。
2．將小管中的混合物混勻，并加入50 µl礦物油或硅化油覆蓋小管中的混合物。
3．蓋緊小管，短暫離心，以使PCR混合物沉于管底。
4．小管在溫度循環(huán)器（PCR儀）中94ºC溫育3分鐘，以使模板DNA*變性。
5. 按以下方法進行25-35個循環(huán)的PCR擴增：
變性        94ºC          30秒 
退火        55ºC          30秒
延伸        72ºC       1分鐘/1 kb
6．72ºC溫育PCR樣本10分鐘，可于4ºC維持。樣本可貯存于-20ºC直至使用。
7．采用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應產(chǎn)物，溴化乙錠染色顯影DNA，用合適分子量標準的DNA作參照。
方法二、熱啟動方法
熱啟動PCR的方法是在反應溫度降至80ºC時添加Taq DNA聚合酶，以保證高特異性PCR產(chǎn)物的合成。
1．如基本的PCR方法所述，添加所有的PCR反應的混合物，但不加Taq DNA 聚合酶。
2．將小管中的混合物混勻，并加入50 µl礦物油或硅化油覆蓋之。
3．蓋緊小管，短暫離心，以便于PCR混合物沉于管底。
4．小管在PCR儀中94ºC溫育3分鐘，以使模板DNA*變性。
5. 94ºC溫育后，維持PCR反應在80ºC。
6．每一PCR反應管添加0.5 µl （2.5 U）的 Taq DNA 聚合酶，注意應保證酶加入到油下面的PCR混合物中。
7．按照基本的PCR方法所述，繼續(xù)完成25-35個循環(huán)的變性、退火和延伸。

【注意事項】
1. PCR引物設計：
引物設計可能是PCR擴增成功zui關(guān)鍵的因素。如引物設計欠佳，可能導致擴增產(chǎn)物不足，甚至擴增失敗，其原因是設計欠佳的引物可導致非特異擴增和/或形成引物二聚體，此又成為PCR反應的競爭性產(chǎn)物，從而進一步抑制PCR產(chǎn)物形成。
在引物設計時必須考慮以下幾個因素，其中zui重要的是引物長度、溶解溫度（Tm）、特異性、引物序列互補問題、G/C 含量和多嘧啶（T,C） 或多嘌呤（A, G）延伸、3’-末端序列等。 
（1）引物長度：由于PCR反應的特異性、退火溫度以及時間均至少部分與PCR引物長度相關(guān)聯(lián)，因此引物長度是PCR擴增是否成功關(guān)鍵的因素。一般PCR引物長度為15-30核苷酸。
（2）溶解溫度（Tm）：因加熱而斷開H鍵，使雙鏈DNA分開或“溶解”為單鏈DNA。溶解溫度（Tm）即指使一半雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA的溫度。Tm可采用下列公式計算：Tm＝2（A+T） + 4（G+C）。
需注意PCR反應至少有兩個（一對）引物，兩個寡核苷酸引物Tm 值應比較接近，不可差異過大。因有較高的Tm值的引物在較低的反應溫度時可發(fā)生錯配，而引物Tm值較低，反應溫度較高時則可能不能發(fā)生作用，因此如引物的Tm值差異較大，可導致PCR擴增效率低下甚至擴增失敗。
（3）引物序列互補：設計引物時應沒有3個堿基以上的內(nèi)引物配對，如引物有這樣具有自我配對的區(qū)域，“彈回”即部分雙鏈結(jié)構(gòu)將發(fā)生在退火反應時。
（4）G/C 含量和多嘧啶（T,C） 或多嘌呤（A, G）延伸：待選擇的引物序列應盡可能是堿基隨意分布，G+C含量平均-避免長A+T和富含G+C的區(qū)域。在引物的堿基組成中GC含量一般為45％-55％。在選擇的引物序列中應沒有多G 或多C延伸，因其可促進非特異性退火，多A 和多T延伸也應避免，因其可“呼吸”和使引物－模板復合物展開延伸，降低擴增的效率。同時多嘧啶（T,C）和多嘌呤（A,G）延伸也應被避免。 
（5）3’-末端序列：為控制引物錯配，應認真地確定PCR引物中3’末端的位置。
總而言之，應重視PCR引物設計，設計PCR引物時應認真小心。對于一個成功的PCR來說，幾個重要因素如引物長度、GC含量和3’序列必須優(yōu)化。理想的引物應為差不多隨意分布的核苷酸混合、GC含量50％、長度約為20個堿基，因此能使Tm值處于56-62ºC范圍。分析靶基因潛在引物位點時，應考慮無單聚合體, 沒有明顯的二級結(jié)構(gòu)形成的傾向，不自我互補，與其他雙鏈靶基因序列沒有明顯的同源性。為避免枯燥無味的設計，節(jié)省時間，減少錯誤，可應用計算機程序優(yōu)化設計、選擇、確定寡核苷酸引物。

2. 模板DNA：
溶解模板DNA于含有低濃度的EDTA（<0.1 mM）的10mM Tris-Cl（pH 7.6）中。DNA的濃度分別為：哺乳動物基因組（100 µg/ml），酵母基因組DNA（1 µg/ml），細菌基因組DNA（0.1 µg/ml），質(zhì)粒DNA（1-5 µg/ml）。
3. 防止污染：由于PCR能夠使單個DNA分子得以擴增，所以應當注意防止反應體系被痕量DNA模板污染，尤其是在待擴增靶序列濃度低的情況下，更有必要采取防備措施。
（1）如有可能，應在裝有紫外燈的層流式工作臺內(nèi)吸加PCR試劑和進行反應。凡不用工作臺時應打開紫外燈。應使工作臺內(nèi)始終置有PCR的微量離心機、一次性手套、整套移液器和其他必需品。由于自動移液器的管部是常見的污染源，因此配液和移液時應當使用配有一次性吸頭和活塞的正向排液式移液器。準備一套特殊的試劑和溶液于PCR。所有的玻璃器皿于150ºC下烘烤6小時，所有塑料器皿、緩沖液、吸頭和離心管使用前必須經(jīng)過高壓處理。
（2）一旦進入吸加PCR試劑的場所并開始工作，就應戴上一副新手套，并應勤于更換。
（3）準備自己使用的成套試劑，分裝為小份，而且在靠近工作臺的冰箱中設立專門位置來保存。這些試劑不得用于其他用途。配制這些試劑時，要用從未接觸過實驗室內(nèi)所用任何DNA的新玻璃用具、塑料用具和移液器。使用后便將這一小份全部廢棄，不得重新置存。
（4）裝有PCR試劑的微量離心管打開之前，應先在工作臺內(nèi)的微量離心機上作瞬時離心（10秒）。這樣可使液體沉積于管底，從而減少污染手套或加樣器的機會。
（5）在加完所有的其他反應成份、包括防止蒸發(fā)用的礦物油后才吸加模板DNA。將模板加入微量離心管后，蓋好離心管并用戴有手套的手指輕輕彈擊管側(cè)壁，以混勻液體。再作瞬時離心（10秒），使水相和有機相分開。
（6）將模板DNA加入PCR系統(tǒng)時，注意切勿形成噴霧，后者有可能污染別的反應。所有并非即用管均應蓋嚴。拿過模板DNA管后應更換手套。    
（7）每一次PCR必須包含陽性和陰性對照。陽性對照用于監(jiān)測PCR反應的效率，而陰性對照用于確定是否存在DNA靶序列的污染。
（8）只要有可能，就應當設置陽性對照反應（即由少量適當?shù)陌行蛄袇⑴c的PCR）。對靶序列DNA所作的適當稀釋工作應于實驗前在實驗室內(nèi)別的位置進行，這樣可防止將靶DNA的濃溶液帶到實驗室專門進行PCR的位置。
（9）必須設置一個不含模板DNA，但含有PCR系統(tǒng)中所有的其他成份的對照反應，這一對照管須在準備好其他所有PCR以后才進行吸加。
4．我們上面介紹的只是一種基本的PCR反應條件，對于具體的每一種PCR反應，反應條件差異很大，需要根據(jù)情況調(diào)整。
（1）時間：上面介紹的時間適用于在0.2 ml薄壁管進行PCR反應，其反應體積為50 µl，熱循環(huán)儀為Perkin-Elmer 9600 或9700、Master Cycler PCR儀（Eppendorf公司）和PTC 100（MJ Research公司）。如PCR的設備和反應體積發(fā)生改變，則時間和溫度均需要調(diào)整。
每一步的時間應從反應混合物達到所需要的溫度后開始計算。一般來說，由混合液原溫度達到所要求溫度的時間需要30-60秒。溫度滯后時間的長短取決于以下幾個因素，包括反應管的類型、反應混合物的體積、熱源（水浴或加熱塊）以及兩個連續(xù)步驟間的溫度差。因此調(diào)節(jié)溫育時間以補償這一滯后時間是非常重要的。
兩寡核苷酸引物之間的距離越遠，合成靶序列全長所需的時間也越長。上面給出的反應時間是按1000個核苷酸的靶序列擬定的。
（2）溫度：選擇寡核苷酸引物到DNA模板的退火溫度是一個折衷的方案。如果降低退火溫度則擴增效率提高，但引物與模板間的錯配現(xiàn)象又可明顯增加。若將溫度提高，則擴增反應的特異性增加，但總的反應效率則會下降。因此理想的辦法是設置一系列對照反應，以確定某一特定擴增反應的zui適退火溫度。
（3）循環(huán)次數(shù)：擴增反應的循環(huán)數(shù)取決于反應混合液中靶DNA的濃度，若將哺乳動物基因組中單拷貝基因擴增至能為瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳所見，至少需要25個循環(huán)。
靶序列的指數(shù)式的擴增不是一個無限制的過程。在正常反應條件下，經(jīng)過25-30個循環(huán)擴增（即擴增約106倍）后，Taq DNA聚合酶的酶量便成為制約反應進行的因素。如需進一步擴增，應將所得的DNA樣品稀釋1000至10000倍后，再作為模板進行新的PCR。
（4）緩沖液：當標準緩沖液于72ºC溫育時，反應體系的pH值將下降1個多單位，致使緩沖液的pH值接近7.2。二價陽離子的存在至關(guān)緊要，鎂離子優(yōu)于錳離子，而鈣離子則無效。鎂離子的*作用濃度相當?shù)停?.5 mM），因此重要的是，所制備的模板DNA中不應含有高濃度的螯合劑，如EDTA；也不應含有高濃度的帶負電荷離子基團，如磷酸根。所以，用作模板的DNA應溶于10 mM Tris-Cl （pH 7.6）, 0.1 mM EDTA （pH 8.0）中。
在較為廣泛的范圍內(nèi)，這種標準緩沖液對于各種模板的寡核苷酸引物都能行之有效，當它并非對于模板與引物的任何一種特定組合都是*的。因此，應當將以上所列條件作為出發(fā)點進行修飾和改良。每當使用靶序列和引物的一種新組合時，或者，dNTPs或引物的濃度變化時，特別要將Mg2+濃度調(diào)至*。dNTPs是反應中磷酸根的主要來源，其濃度的任何變化都將影響到Mg2+的有效濃度。我們建議設置一組反應，其中每一反應的Tris-Cl （10 mM）和氯化鉀 （50 mM）濃度相同，而氯化鎂濃度不同（0.05-5 mM，每次增加0.5 mM）。反應結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色來比較各擴增產(chǎn)物的量。
PCR可在熱循環(huán)儀（即PCR儀）中自動進行，以使反應各循環(huán)標準化。
5. 一般來說，如*次用新的模板DNA、新的引物或者新制備的耐熱DNA聚合酶作PCR，擴增將不如預期理想。PCR反應條件需仔細調(diào)整，以抑制非特異擴增和（或）提高目標DNA的產(chǎn)量。
6. 一個成功的PCR擴增反應，可出現(xiàn)一個顯而易見的與預期大小一樣長度的DNA片段，此可通過DNA序列分析、Southern 雜交和或限制性圖譜分析確定。