一、人工純化
人工純化，即利用人為手段造成某一細(xì)胞生長(zhǎng)有利的環(huán)境條件，抑制其他細(xì)胞的生長(zhǎng)從而達(dá)到純化細(xì)胞的目的。

1、酶消化法
酶消化法是比較常用的純化方法，不僅對(duì)貼壁細(xì)胞可行，能利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同，使兩者分開(kāi)，達(dá)到純化的目的，對(duì)貼壁細(xì)胞與半貼壁及粘附細(xì)胞間的分離純化也是十分有效的。
(1)上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的分離純化
兩者在胰蛋白酶的作用下，由于成纖維細(xì)胞先脫壁，而上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間才脫壁，特別是在原代細(xì)胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯，故可采用多次差別消化方法將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開(kāi)，方法如下：
①采用常規(guī)消化傳代方式 將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)兩次，每次加1mL(25mL培養(yǎng)瓶)來(lái)回輕搖1-2次，使胰蛋白酶流過(guò)所有細(xì)胞表面，然后倒掉。
②蓋好瓶塞(或蓋)，將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)纖維樣細(xì)胞變圓，部分脫落，立即加入2mL有血清的培養(yǎng)液終止消化。
③用彎頭吸管輕輕吹打纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)的區(qū)域(可事先在鏡下用記號(hào)筆在培養(yǎng)瓶上劃出記號(hào))。吹打時(shí)不要用力，也不要吹打上皮細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)域。吹打結(jié)束后，再用少量培養(yǎng)液漂洗一遍，然后加入適量培養(yǎng)液于瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，也可重復(fù)上述操作再進(jìn)行一次，隔幾日后或下次傳代時(shí)，再進(jìn)行上述操作，經(jīng)過(guò)幾次處理，就可將成纖維細(xì)胞去除或?qū)烧叻珠_(kāi)。
(2)骨髓基質(zhì)肌樣細(xì)胞的純化
在血液細(xì)胞和骨髓細(xì)胞靜置培養(yǎng)時(shí)，常有許多肌樣細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，但也有許多淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞粘附其上，種類(lèi)混雜，鑒于粘附細(xì)胞貼壁不牢固，也可用酶消化法使粘附細(xì)胞脫壁分離，以達(dá)到骨髓基質(zhì)細(xì)胞或血液中肌樣細(xì)胞與淋巴細(xì)胞分開(kāi)和純化的目的。其方法如下：
①待基質(zhì)或肌樣細(xì)胞基本形成單層時(shí)，倒去舊液，加入無(wú)鈣、鎂PBS漂洗，并用力搖動(dòng)后倒掉，反復(fù)洗2~3次后，一方面可洗去血清和鈣鎂離子以助酶消化，另一方面又可使大部分粘附細(xì)胞被洗掉，但仍留有不少粘附細(xì)胞。
②將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶1mL(25mL培養(yǎng)瓶)，輕輕搖動(dòng)讓胰蛋白酶流過(guò)細(xì)胞表面，作用1~2分鐘后再輕輕搖動(dòng)1~2次后倒去。
③蓋好瓶蓋，在普通顯微鏡下觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)或肌樣細(xì)胞由于貼壁較牢固未脫壁，而原先粘附的細(xì)胞已浮起，此時(shí)再加2mL PBS洗一次倒掉，盡量除去粘附細(xì)胞。
④加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，再繼續(xù)用力搖動(dòng)后倒掉，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。隔幾日或下次傳代前，再進(jìn)行上述操作，經(jīng)過(guò)幾次處理和傳代培養(yǎng)后就可將粘附細(xì)胞去除，將兩者分開(kāi)，達(dá)到使骨髓基質(zhì)細(xì)胞或肌樣細(xì)胞純化的目的。
2、細(xì)胞因子依賴(lài)純化法
人和動(dòng)物組織中某些細(xì)胞需要有特殊的細(xì)胞因子存在的微環(huán)境才能長(zhǎng)期存活和生長(zhǎng)繁殖，如IL-2是T細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的細(xì)胞因子，BCGF是B細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，體外培養(yǎng)中淋巴細(xì)胞若加入IL-2就可使T細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，形成IL-2依賴(lài)的T細(xì)胞系，如CTLL-2細(xì)胞株，而其他細(xì)胞則自然被淘汰，采用此法還建立了IL-6依賴(lài)的細(xì)胞系，如B9、CTD7細(xì)胞株。
3、機(jī)械刮除法
原代培養(yǎng)時(shí),如果上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為分區(qū)成片混雜生長(zhǎng)，每種細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長(zhǎng)在瓶壁上。可采用機(jī)械的方法去除不需要的細(xì)胞區(qū)域而保留需要的細(xì)胞區(qū)域，其方法如下：
(1)將要純化細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，在凈化室內(nèi)放在倒置顯微鏡監(jiān)視下進(jìn)行。
(2)用硅橡皮刮子在不需要生長(zhǎng)的細(xì)胞區(qū)域推劃，使細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中，注意不要傷及所需細(xì)胞。
(3)推劃后用培養(yǎng)液沖洗振搖兩次倒掉，即可將培養(yǎng)基加入原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。
(4)數(shù)日后如發(fā)現(xiàn)不需要的細(xì)胞又長(zhǎng)出，可再進(jìn)行上述操作，這樣反復(fù)多次可以純化細(xì)胞。操作過(guò)程中要嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止污染。
4、電烙篩選法
在貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)，往往在培養(yǎng)瓶的細(xì)胞層中會(huì)出現(xiàn)分散的轉(zhuǎn)化灶，轉(zhuǎn)化灶區(qū)域細(xì)胞密集、排列規(guī)則，有明顯生長(zhǎng)趨勢(shì)，與周邊未能轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有明顯的區(qū)域界限，此時(shí)即可用機(jī)械刮除法去除未轉(zhuǎn)化細(xì)胞，也可用電烙篩選法燙死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞而保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞。其方法如下：
(1)倒去舊液，并用記號(hào)筆劃出轉(zhuǎn)化灶的區(qū)域。
(2)用加熱的微型電烙器(類(lèi)似焊接用的電烙鐵)將轉(zhuǎn)化灶周邊的細(xì)胞全部燙死，只保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞。在單細(xì)胞克隆篩選時(shí)，也可用此法將單個(gè)細(xì)胞周?chē)募?xì)胞殺死，然后在適應(yīng)性培養(yǎng)基中(50%是舊液)繼續(xù)培養(yǎng)，即可達(dá)到純化的目的。
5、反復(fù)貼壁法
成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞相比，其貼壁過(guò)程快，大部分細(xì)胞能在短時(shí)間內(nèi)(大約10~30min)完成附著過(guò)程(但不一定*伸展)，而上皮細(xì)胞(大部分)在短時(shí)間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，利用此差別可以純化細(xì)胞。其方法如下：
(1)將細(xì)胞懸液接種在一個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)(培養(yǎng)液內(nèi)不含血清，此時(shí)上皮細(xì)胞貼壁更慢)靜置20分鐘。
(2)在倒置顯微鏡下觀(guān)察，見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁，稍加搖動(dòng)也不浮起時(shí)，將細(xì)胞懸液倒入另一培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)靜置培養(yǎng)20min，然后再重復(fù)上述操作后，即可將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分隔開(kāi)，在第1瓶和第2瓶以成纖維細(xì)胞為主，往后幾瓶即以上皮細(xì)胞為主，下次傳代時(shí)再按上述方法處理，就可使兩者達(dá)到*分開(kāi)的目的。

二、 自然純化
自然純化即利用某一種類(lèi)細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)，在長(zhǎng)期傳代過(guò)程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他生長(zhǎng)慢的細(xì)胞，靠自然增殖的潛力，zui后留下生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)旺的細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。但這種方法常無(wú)法按照需要和實(shí)驗(yàn)要求及目的來(lái)選擇細(xì)胞，此法花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，留下來(lái)的往往是成纖維細(xì)胞。僅有那些惡性變的腫瘤細(xì)胞或突變的細(xì)胞可以通過(guò)此方法而保留下來(lái)，不斷純化而建立細(xì)胞系。