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大鼠場景恐懼實驗方法點擊次數(shù):3693 更新時間:2011-07-04

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       場景恐懼(cued and contextual fear conditioning)是基于巴普洛夫條件反射而建立的。它測定動物學習、記憶不悅經(jīng)歷(aversive experience)和環(huán)境暗示之間關(guān)聯(lián)的能力。常用聲音或光暗示作為條件刺激(conditioning stimulus,CS),以厭惡性刺激(如足電擊)作為非條件刺激(unconditioned stimulus,US),二者配對出現(xiàn)。經(jīng)過這種CS-US訓練,動物不僅學會聲音和電擊之間存在,而且知道電擊和周圍環(huán)境之間也存在某種(context)。前者為聽覺暗示條件恐懼(auditory cue fear conditioning)或暗示條件恐懼(cued fear conditioning),后者為關(guān)聯(lián)條件恐懼(contextual fear conditioning)。恐懼是非靈長類動物少有的幾種情感反應之一。動物經(jīng)歷條件恐懼后,當再次接觸條件刺激時,會產(chǎn)生一系列的生理反應,包括自主神經(jīng)緊張、應激激素分泌增加以及防御行為增多,等等。凝滯(freezing)即是動物防御行為的一種,是指動物除呼吸之外沒有任何其他活動,猶如在黑夜處于迎面而來的汽車強燈照射之下的驚鹿,一動不動。它被認為是評價嚙齒類動物恐懼的可靠指標。

參與條件關(guān)聯(lián)學習過程的腦部結(jié)構(gòu)主要為杏仁核和海馬。前者調(diào)節(jié)恐懼,后者調(diào)節(jié)與恐懼性事物相關(guān)聯(lián)的學習認知。所以,這一模型主要用于杏仁核和海馬依賴的記憶。動物不需要禁水或禁食,且實驗設備較為簡單,訓練時間相對較短。因此,該模型廣泛用于轉(zhuǎn)基因小鼠敲除小鼠的行為表型研究。
  • 一、實驗設備
包括條件恐懼箱、隔音箱和關(guān)聯(lián)條件箱,由上海欣軟信息科技有限公司研發(fā)制作。條件恐懼箱包括與箱底格柵地板相聯(lián)的電擊發(fā)生器(可產(chǎn)生0.1~1.0mA的各種強度的電擊)、聲音發(fā)生器(可產(chǎn)生寬頻的卡嗒聲或低頻音),并與計算機相聯(lián)。隔音箱裝有一燈、一小風扇(用于通風和產(chǎn)生背景音)以及一個與聲音發(fā)生器相聯(lián)的擴音器。隔音箱門上有一貓眼,用于觀察操作箱內(nèi)的動物。一個隔音箱內(nèi)可放置兩個操作箱,這樣可同時觀測兩只動物,但兩動物彼此不能互相看見。關(guān)聯(lián)箱由透明有機玻璃制成,有可移動的格柵式地板和紗窗式頂部。為防止動物滑至格柵下面,格柵條之間距離應足夠短。對小鼠和年幼大鼠,關(guān)聯(lián)條件箱通常為26cm*21cm*10cm;格柵地板由不銹鋼條(直徑1.5mm,中央間距小鼠為0.5cm、年幼大鼠為1.2cm)組成。對成年大鼠,關(guān)聯(lián)箱通常為29cm*23.5cm*19.5cm,格柵地板包括16根不銹鋼條(直徑2.5cm、中央間距為1.25cm)。此外,還有電壓計和聲強計,用來檢測刺激強度。
  • 二、實驗方法
分為訓練和測試兩階段
(一)訓練階段(*天)
 
1.調(diào)試儀器,以確保格柵地板有電流刺激,擴音器有聲音刺激,并分別記錄電流強度和聲音強度(分貝)。
2.將大鼠放入條件恐懼箱2min(A相),記錄這zui初2min內(nèi)動物的凝滯(freezing)時間作基線。
3.接著加入卡嗒聲,80Db,30s(B相)。
4.緊接著再給予電擊,0.35mA,2s(C相),完成一輪訓練。如需要多輪訓練,則重復A、B、C三相訓練即可。
5.記錄整個訓練階段動物凝滯時間(s),用以測量動物的非條件恐懼(unconditioned fear)。
6.將大鼠移開操作箱。用70%的酒精或4%醋酸溶液*清潔操作箱,以備進行下一批動物的訓練。
(二)測試階段 在訓練后的第二天進行,包括關(guān)聯(lián)(context)測試、變更關(guān)聯(lián)(altered context)或條件刺激前(pre-conditioning-stimulus,pre-CS)測試以及條件刺激(conditioning stimulus,CS)測試。測試階段沒有電擊刺激。關(guān)聯(lián)測試和變更關(guān)聯(lián)測試中也沒有聽覺條件刺激,但每只動物所用的操作箱應與訓練階段的相同。
1.關(guān)聯(lián)測試 將動物放入箱內(nèi),計算機自動記錄動物的凝滯行為。若用人工觀察,則觀察者(應不知道動物的處理或基因型)用靜聲秒表通過箱門上的貓眼(小窗口)觀察動物的行為并計分:凝滯為1分,活動(moving)為0分(也有只記錄凝滯時間)。每10秒觀察一次,共5min,這樣可記錄到30次(bout)可能的凝滯(即zui大凝滯得分為30分)。用在這一階段記錄到的、動物在同一操作箱內(nèi)的凝滯時間測量動物的關(guān)聯(lián)條件恐懼(contextually conditioned fear)。此為關(guān)聯(lián)測試。觀察結(jié)束后將動物放回籠內(nèi),清潔操作箱,進行下一只動物的觀察。
2.變更關(guān)聯(lián)測試和聽覺條件刺激測試 關(guān)聯(lián)測試1h后進行。操作如下:
(1)將計算機調(diào)至所需程序。
(2)操作箱進行如下改造:1用平滑塑料板取代關(guān)聯(lián)條件箱內(nèi)的格柵地板;2在箱的對角線加一塊有色塑料板,這樣將長方體的操作箱變成三角體;3改變嗅覺暗示(olfactory cues)。例如,可在箱的一角放一個裝有一滴桔子汁或檸檬汁的杯子,或直接將一滴果汁涂于墻上。然后開始變更關(guān)聯(lián)和聽覺條件刺激實驗。
(3)將動物放入經(jīng)改造后的關(guān)聯(lián)箱(從關(guān)聯(lián)實驗中的*只動物開始)。
(4)啟動預置的實驗程序,每隔10秒記錄動物的凝滯和非凝滯得分(分別為1和0分),共記錄3min,即18次可能的凝滯記錄(凝滯得分為18)。
(5)加入聽覺條件刺激30秒。重復上述記錄3分鐘。
(6)將動物放回籠子,清潔操作箱,進行下一只動物的測試。
  • 三、結(jié)果計算與分析
因為不同類型的學習凝滯時間不同,所以zui常使用百分計:
關(guān)聯(lián)=(關(guān)聯(lián)測試中的凝滯得分/30)*100%
變更關(guān)聯(lián)(條件刺激前)=(變更關(guān)聯(lián)中的凝滯得分/18)*100%
聽覺暗示(條件刺激)=(聽覺條件刺激中凝滯得分/18)*100%
對每一不同的凝滯測試計分進行重復測量單因素方差分析(ANOVA),從此比較關(guān)聯(lián)和變更關(guān)聯(lián)或聽覺暗示之間的條件恐懼程度,并確定組間差異。一般而言,動物在聽覺暗示中的凝滯行為要比關(guān)聯(lián)測試的多。在變更關(guān)聯(lián)測試中,由于關(guān)聯(lián)條件箱已被改造得“面目全非”,訓練時動物獲得的對周圍環(huán)境的關(guān)聯(lián)幾乎不存在,因此,凝滯行為應該zui少。關(guān)聯(lián)與變更關(guān)聯(lián)差別很大,凝滯計分差別越大。
如果動物在第二天的關(guān)聯(lián)測試和聽覺暗示測試中出現(xiàn)凝滯,而在變更關(guān)聯(lián)測試中不表現(xiàn)凝滯行為,則可認定:動物的感覺和運動功能均正常;能記住前一天與厭惡刺激配對出現(xiàn)的暗示信號;能分辨前一天不與厭惡刺激配對出現(xiàn)的暗示信號,說明動物具有正常的記憶。這些測試中的任何一項增強或減弱,提示調(diào)節(jié)記憶情感部分的神經(jīng)解剖、神經(jīng)遞質(zhì)和基因可能發(fā)生變化。
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